Клеточные механизмы, изучение поведения клеток

Архив рубрики «Препараты»

Baserga с соавторами (1965) вводили мышам с асцитным раком Эрлиха по 0,5 мкг актиномицина D каждые 2 ч. Уже через 30 мин после первого введения синтез РНК был значительно снижен. Индекс метки 3Нтимидином начинал уменьшаться через 4Щ ч и достигал минимума через 8V2 ч. Интенсивность включения 3Нтимидина на меченую клетку и активность пула тимидиновой кислоты в течение всего периода наблюдения не изменялись. Это показывает, что актиномицин D тормозил вступление клеток в фазу S, воздействуя на процессы, происходящие за 4′/г ч до начала синтеза ДНК, и не влиял на синтез ДНК в фазе S. В течение б’/г8′/г ч актиномицин D не влиял на число митозов’ и на процент меченых митозов при предварительном введении 3Нтимидина и, следовательно, не нарушал перехода клеток из фазы G2 в митоз. Это показывает, что в клетках асцитного рака Эрлиха фаза G: более чувствительна к низким дозам актиномицина D, чем фаза G2. При этом отсутствие влияния на клетки в фазе G2 имело место при полном блокировании перехода в фазу S.

Добавление актиномицина D или циклогексемида к синхронизированной культуре клеток HeLa в фазе Gi полностью тормозило последующий синтез ДНК (Kim е. a., 1968b). Если ингибитор добавляли после перехода 60 клеток в фазу S, то пуромицин тормозил синтез ДНК сразу, а актиномицин D через 2 ч. Методом двойной метки было показано, что актиномицин D быстрее и в большей степени тормозит синтез ДНК в клетках, вступивших в фазу S, после, чем до его добавления. Воздействие ингибиторов в течение 3 ч на клетки в фазе Gi лишь несколько замедляло переход в фазу S, на клетки в фазе S не влияло на интенсивность синтеза. Таким образом, длительное торможение синтеза РНК и белка в клетках HeLa оказывало влияние на инициацию синтеза ДНК и на этот синтез в клетках фазы S.

В синхронной культуре фибробластов L добавление актиномицина D в очень низкой концентрации (540 иг/мл) на 2 ч в начале фазы Gi замедляло переход клеток в фазу S (Hatfield е. а., 1973). Степень торможения включения 3Нуридина в ядрышко коррелировала с длительностью блокирования перехода клеток в фазу S при разных концентрациях препарата. При воздействии актиномицина D на клетки в середине фазы G] влияние на переход в фазу S было значительно меньше, чем при воздействии в начале фазы Gi. Следовательно, к актипомицину D были чувствительны только те процессы, связанные с инициацией синтеза ДНК, которые происходили в начале фазы Gi.

Rickinson (1970) также исследовал влияние на клеточный цикл синхронизированных фибробластов L актиномицина D в концентрации, избирательно тормозящей синтез РНК в ядрышке (40 нг/мл). Добавление актиномицина D через 1 ч после посева клеток резко тормозило, добавление через 4 ч не влияло на переход клеток в фазу S. Следовательно, актиномицин D был эффективен только в начале фазы Gi. Опыты с кратковременным воздействием ингибитора дали такой же результат. Действие актиномицина D в течение первых 2 ч фазы G: тормозило, а действие в течение 35 ч фазы Gj не влияло на инициацию синтеза ДНК. В немногочисленных клетках, которые вошли в фазу S, несмотря на присутствие в среде актиномицина D, интенсивность включения 3Нтимидина не была снижена. Воздействие актиномицина D на клетки в фазе G2 не влияло на время их вступления в митоз, а воздействие на клетки в фазах Gi и S значительно замедляло время деления. При этом, чем в более ранний период цикла начиналось действие актиномицина D, тем на большее время задерживалось деление. Торможение деления клеток, обработанных актиномицином D в начале фазы Gb очевидно, является следствием задержки их вступления в фазу S, а обработанных в конце фазы Gi и в фазе S следствием бло кирования в фазе G2. Следовательно, в опытах Rickinson (1970) торможение синтеза РНК блокировало клетки в фазе G2 только в том случае, если торможение начиналось в фазах Gi и S. Таким образом, в культуре фибробластов L актиномицин D в концентрации, избирательно тормозящей синтез РНК в ядрышке, блокировал переход в фазу S клеток в начале фазы Gb вызывал вторичное блокирование клеток в фазе G2 и не влиял на синтез ДНК в фазе S и переход клеток из фазы G2 в митоз. Вторичное блокирование фазы G2 показывает, что синтез РНК в ядрышке, необходимый для деления, происходил в фазе S.

Doida и Okada (1972) исследовали влияние высокой концентрации актиномицина D (0,5 мкг/мл) и пуромицина на клеточный цикл в культуре лимфобластов L5178Y. Оба ингибитора не влияли на переход клеток из митоза в фазу Gi. Переход клеток в фазу S был заторможен при действии актиномицина в начале фазы Gb а под влиянием пуромицина в середине и конце фазы Gi. Однако tGi в этих клетках составляет всего Р/2 ч, поэтому определение периодов чувствительности является приближенным. Актиномицин D тормозил переход. из фазы G2 в митоз в значительно меньших концентрациях, чем переход из фазы Gj в фазу S. В случае фибробластов L и клеток асцитного рака Эрлиха наблюдалось обратное соотношение (см. выше). Таким образом, сравнительная чувствительность клеток в фазах Gj и G2 к актиномицину D отличается в клетках разного типа. Пуромицин в одинаковой концентрации тормозил вступление клеток в митоз и в фазу S. В фазе Gi чувствительность к пуромицину проявлялась позже, чем чувствительность к актиномицину D, что соответствует последовательному синтезу РНК и белка, необходимых для инициации синтеза ДНК В ряде работ детально изучалось влияние торможения синтеза белка на переход клеток в фазу S. В культуре клеток HeLa вся фаза Gi была одинаково чувствительна к пуромицину и циклогексемиду. Воздействие ингибиторов в течение 2 ч на разных этапах фазы Gi вызывало одинаковую задержку вступления клеток в фазу S (Terasima, Yasukawa, 1966). Длительность задержки перехода в фазу S находилась в линейной зависимости от времени действия пуромицина. В культуре клеток хомячка пуромицин задерживал переход клеток в фазу S на время, равное продолжительности его воздействия, плюс время «дополнительной задержки» (Schneiderman е. а., 1971). Величина дополнительной задержки находилась в линейной зависимости от возраста клетки в первой половине фазы Gi, достигала максимума в середине фазы Gi и затем не изменялась. Таким образом, к пуромицину по критерию длительности блокирования перехода в фазы S были более чувствительны клетки во второй половине фазы Gi. Ве личина дополнительной задержки также зависела от времени действия пуромицина и достигала максимума 4,25 ч при действии пуромицина в течение 6 ч. Дополнительная задержка перехода в фазу S указывает, по мнению Schneiderman с соавторами (1971), на время, за которое восстанавливается белок инициатор синтеза ДНК, распавшийся за время действия пуромицина. Было рассчитано, что за 2 ч распадается половина этого белка. Действие пуромицина на клетки в фазе S полностью тормозило синтез ДНК. Однако сразу после удаления ингибитора синтез ДНК восстанавливался. Отсутствие дополнительной задержки синтеза ДНК при действии пуромицина в фазе S показывает, что в этих клетках для восстановления синтеза ДНК нет необходимости в повторении явлений, определяющих инициацию синтеза ДНК Явление дополнительной задержки перехода клеток в фазу S при действии пуромицина в фазе G] не является свойством всех клеток, В клетках L (Terasima, Yasukawa, 1966) и HeLa (Kim е. а., 1968в) длительность задержки перехода в фазу S была меньше времени действия ингибиторов синтеза белка.