Клеточные механизмы, изучение поведения клеток

Май 2011

Для детального исследования влияния митотических ингибиторов на клеточную кинетику в наших опытах мышам с асцитным раком Эрлиха вводили внутрибрюшинно 20 мкг винбластина через 2 сут после перевивки 107 клеток. В течение 24 ч каждые 3 ч подсчитывали митотический индекс (число метафаз) и определяли пульсовой индекс метки (фиксация через 30 мин после введения 3Нтимидина) ( 6). Митотический индекс возрастал в течение 9 ч, причем уже после 3 ч скорость его увеличения замедлялась. После 9 ч митотический индекс уменьшался и через 1824 ч митозы практически не обнаруживались. Если за 30 мин до винбластина ввели 3Нтимидин, то через 3 ч после введения винбластина доля меченых метафаз среди всех метафаз составляла 30. Это соответствует вступлению в митоз за это время в основном клеток из фазы G2, так как среднее to 2 ставляет 3 ч. Через 6, 9 и 12 ч после введения винбластина число меченых метафаз составляло 86, 98 и 98 соответственно. Доля немеченых метафаз среди всех клеток составляла через 3 ч 6,9, через 6 ч 2,2. Это показывает, что между 3 и 6 ч около 70 немеченых метафаз, а между 3 и 9 ч все немеченые метафазы переходят в интерфазное состояние или лизируются. Следовательно, величина митотического индекса после введения винбластина отражает два процесса ■ накопление клеток в митозе и исчезновение блокированных метафаз. Это, очевидно, объясняет нелинейный характер накопления митозов. При введении 20 мкг винбластина выжившая фракция через 24 ч составляла 1, а общее число клеток в опухоли не уменьшалось.

Существует три основных метода определения выжившей фракции клеток в опухолях: 1) метод конечного разведения, 2) метод колоний, 3) косвенные методы, основанные на определении длительности жизни животных или скорости роста опухолей.
При всех методах определения выжившей фракции устанавливается число опухолевых клеток, вызывающих рост опухоли, гибель животного или образование колонии, в контроле и после введения препарата. Отношение числа живых клеток в контроле и опыте составляет величину выжившей фракции.
Метод конечного разведения был разработан Hewitt (1958) на модели перевиваемого лимфатического лейкоза мышей и затем применен для солидных и асцитных опухолей. Метод заключается во введении животным серийных разведений взвеси опухолевых клеток и состоит из следующих

Так, Shirakawa и Frei (1970) показали, что в лейкемии L1210, леченной бис-р-хлорэтилнитрозомочевиной, выжившая фракция составляет при использовании методов биологического титрования и витальной окраски 0,1 и 20% соответственно. Goodman, Acker-man (1973) показали, что витальная окраска не обнаруживает гибели клеток лейкемии L1210 после инкубации их в среде с сарколизином, хлорамбуцилом, метотрексатом, 6-мер-каптопурином, актиномицином D и винбластином. Поскольку перечисленные препараты активны in vivo при лейкемии L1210, эти данные показывают, что метод витальной окраски не пригоден для определения цитотоксического действия хи-миотерапевтических препаратов. Drewinko, Gottlieb (1973) показали, что после воздействия адриамицином на культуру клеток лимфомы выжившая фракция составляла 0,001% при определении методом колоний и 38% при определении методом витальной окраски. Это еще раз подчеркивает неадекватность метода витальной окраски для изучения гибели опухолевых клеток. Очевидно, цитологическими методами определяются наиболее грубые и быстрые формы гибели клеток, сопровождающиеся распадом ядра и нарушением проницаемости. Поэтому многие авторы при подсчете числа вводимых опухолевых клеток исключают клетки, проницаемые для красителей, как определенно погибшие.

Следует подчеркнуть, что все эти методы основаны на определении способности клеток к размножению и что роль цитологических и гистологических методов при изучении гибели клеток весьма ограниченна. Было бы крайне важно научиться отличать цитологическими методами живые и по-
гибшие опухолевые клетки. Однако в настоящее время это не представляется возможным, что затрудняет определение жизнеспособности клеток в опухолях человека и решение ряда важных вопросов, например установление зависимости жизнеспособности клетки от ее локализации в опухоли. Представляется маловероятным, что будут найдены цитологические методы определения выжившей фракции, поскольку формы гибели клеток весьма разнообразны. Клетки с различными формами распада ядер (кариорексис, кариопикноз) не являются живыми, и подсчет числа таких клеток в определенных случаях дает полезную информацию. Использование окраски эозином или трипановым синим для определения жизнеспособности клеток не является перспективным, так как этот метод дает ошибочные результаты.

Блеомицин не влияет на переход по циклу клеток СНО, обработанных в фазах Gi, Бив митозе. Переход клеток в митоз из фазы G2 тормозился через 1 ч после добавления блеомицина. Актиномицин D в этих клетках также тормозил вступление в митоз через 1 ч, что указывает на торможение.