Клеточные механизмы, изучение поведения клеток

В нескольких работах для оценки влияния на переход клеток в фазу S определялась выжившая фракция после действия препаратов, специфически убивающих клетки в этой фазе. Baceheti и Whitmore (1969а) синхронизировали культуру фибробластов L 3Нтимидином в концентрации, вызывающей гибель клеток в фазе S. Через 6 ч, когда живые клетки находились в коице фазы Gi, добавляли оксимочевину и немеченый тимидин. В этих условиях оксимочевина вызывала гибель клеток. Следовательно, часть клеток переходила из поздней фазы Gi в фазу S, в которой клетки погибали под действием оксимочевины. В течение 1 ч после добавления оксимочевины и немеченого тимидина гибель клеток была такой же, как в культуре, подвергавшейся действию меченого тимидина, а в последующий период гибель клеток замедлялась.

Подробная информация о влиянии химиотерапевтических препаратов на клеточный цикл может быть получена при одновременном использовании методов авторадиографии и цитофотометрии ДНК Tobey и Crissman (1972) методом микрофлуорометрии определяли содержание ДНК в огромном числе (десятки тысяч) клеток культуры СНО, что давало возможность получить точное распределение количества ДНК и определить число клеток в разных фазах цикла. В культуре, находившейся в среде без изолейцина 30 ч, почти все клетки были в фазе Gi и лишь единичные клетки в фазе G2. К такой культуре добавляли одновременно изолейцин и испытуемый препарат и через 10 ч определяли количество ДНК и включение 3Нтимидина при непрерывной метке после отмывания от препарата. В таких опытах наблюдались три основных типа реакции на препарат: 1) если препарат блокировал клетки в фазе Gb то количество ДНК оставалось на уровне 2 С и меченые клетки появлялись лишь через 4 ч после добавления 3Нтимидина, что соответствует tGi в контроле, 2) если препарат не влиял на фазу Gb но тормозил переход из фазы Gi в фазу S, то количество ДН. К также сохранялось на уровне 2 С, но клетки быстро вступали в фазу S, 3) при отсутствии влияния на фазу Gi и переход из фазы Gi в фазу S количество ДНК возрастало в присутствии препарата и клетки быстро делились после его удаления. Действие оксимочевины и арабинозилцитозина характеризовалось реакцией второго типа. Клетки при действии этих препаратов делились после их удаления быстрее, чем в контроле. Это показывает, что в присутствии препаратов клетки проходили фазу Gi и накапливались в конце фазы Gj. При действии на культуру блеомицина в популяции содержались клетки с количеством ДНК, соответствующим фазе S, и накапливалось значительное число клеток в фазе G2. После удаления препарата клетки не делились. Следовательно, действие блеомицина характеризовалось реакцией третьего типа с дополнительным блокированием клеток в фазе G2.

Для изучения закономерностей восстановления пролиферации Wheeler с соавторами (1972) инкубировали культуру НЕр2 с препаратами 26 ч и определяли число клеток, вступивших в митоз в течение последующих 26 ч. Только после инкубации с арабинозилцитозином, оксимочевиной и гуаназолом в митоз вступало значительное число клеток, а после инкубации с остальными препаратами менее 5. Степень восстановления пролиферации не коррелировала с величиной выжившей фракции. После инкубации с 6меркаптопурином и 6метилтиопуринрибонуклеозндом в митоз вступало 4 и 0,2 клеток, а выжившая фракция была значительно больше этих величин 35 и 40 соответственно. После воздействия арабинозилцитозина и гуаназола в митоз вступали 35 и 71 клеток, а выжившая фракция была значительно меньше этих величин 15 и 45 соответственно. После прекращения действия всех препаратов индекс метки увеличивался до 70 90 и, следовательно, последействие всех препаратов не было связано с торможением синтеза ДНК.

Для оценки влияния препаратов на переход из фазы Gi в фазу S Wheeler с соавторами (1972) определяли индекс метки при непрерывном присутствии 3Нтимидина в среде в течение 28 ч. Арабинозилцитозин, 6меркаптопурин, 6метилтиопуринрибонуклеозид и 6тиогуанин замедляли переход клеток в фазу S сразу после добавления в среду, а метотрексат после 12го часа. Остальные четыре препарата не влияли на нарастание индекса метки. Таким образом, все девять препаратов, изученных в работе Wheeler с соавторами (1972), тормозили синтез ДНК и не влияли на фазу G2 и пять препаратов из девяти блокировали переход из фазы Gi в фазу S. Эти данные хорошо согласуются с описанным выше различием в действии метотрексата на клеточный цикл при остром миелоидном лейкозе человека и асцитной лейкемии L1210. Блокирование перехода из фазы G в фазу S происходило только в клетках L1210, в которых метотрексат блокировал синтез пуринов.