Клеточные механизмы, изучение поведения клеток

Rickinson (1970) также исследовал влияние на клеточный цикл синхронизированных фибробластов L актиномицина D в концентрации, избирательно тормозящей синтез РНК в ядрышке (40 нг/мл). Добавление актиномицина D через 1 ч после посева клеток резко тормозило, добавление через 4 ч не влияло на переход клеток в фазу S. Следовательно, актиномицин D был эффективен только в начале фазы Gi. Опыты с кратковременным воздействием ингибитора дали такой же результат. Действие актиномицина D в течение первых 2 ч фазы G: тормозило, а действие в течение 35 ч фазы Gj не влияло на инициацию синтеза ДНК. В немногочисленных клетках, которые вошли в фазу S, несмотря на присутствие в среде актиномицина D, интенсивность включения 3Нтимидина не была снижена. Воздействие актиномицина D на клетки в фазе G2 не влияло на время их вступления в митоз, а воздействие на клетки в фазах Gi и S значительно замедляло время деления. При этом, чем в более ранний период цикла начиналось действие актиномицина D, тем на большее время задерживалось деление. Торможение деления клеток, обработанных актиномицином D в начале фазы Gb очевидно, является следствием задержки их вступления в фазу S, а обработанных в конце фазы Gi и в фазе S следствием бло кирования в фазе G2. Следовательно, в опытах Rickinson (1970) торможение синтеза РНК блокировало клетки в фазе G2 только в том случае, если торможение начиналось в фазах Gi и S. Таким образом, в культуре фибробластов L актиномицин D в концентрации, избирательно тормозящей синтез РНК в ядрышке, блокировал переход в фазу S клеток в начале фазы Gb вызывал вторичное блокирование клеток в фазе G2 и не влиял на синтез ДНК в фазе S и переход клеток из фазы G2 в митоз. Вторичное блокирование фазы G2 показывает, что синтез РНК в ядрышке, необходимый для деления, происходил в фазе S.

В синхронной культуре фибробластов L добавление актиномицина D в очень низкой концентрации (540 иг/мл) на 2 ч в начале фазы Gi замедляло переход клеток в фазу S (Hatfield е. а., 1973). Степень торможения включения 3Нуридина в ядрышко коррелировала с длительностью блокирования перехода клеток в фазу S при разных концентрациях препарата. При воздействии актиномицина D на клетки в середине фазы G] влияние на переход в фазу S было значительно меньше, чем при воздействии в начале фазы Gi. Следовательно, к актипомицину D были чувствительны только те процессы, связанные с инициацией синтеза ДНК, которые происходили в начале фазы Gi.

Добавление актиномицина D или циклогексемида к синхронизированной культуре клеток HeLa в фазе Gi полностью тормозило последующий синтез ДНК (Kim е. a., 1968b). Если ингибитор добавляли после перехода 60 клеток в фазу S, то пуромицин тормозил синтез ДНК сразу, а актиномицин D через 2 ч. Методом двойной метки было показано, что актиномицин D быстрее и в большей степени тормозит синтез ДНК в клетках, вступивших в фазу S, после, чем до его добавления. Воздействие ингибиторов в течение 3 ч на клетки в фазе Gi лишь несколько замедляло переход в фазу S, на клетки в фазе S не влияло на интенсивность синтеза. Таким образом, длительное торможение синтеза РНК и белка в клетках HeLa оказывало влияние на инициацию синтеза ДНК и на этот синтез в клетках фазы S.

Baserga с соавторами (1965) вводили мышам с асцитным раком Эрлиха по 0,5 мкг актиномицина D каждые 2 ч. Уже через 30 мин после первого введения синтез РНК был значительно снижен. Индекс метки 3Нтимидином начинал уменьшаться через 4Щ ч и достигал минимума через 8V2 ч. Интенсивность включения 3Нтимидина на меченую клетку и активность пула тимидиновой кислоты в течение всего периода наблюдения не изменялись. Это показывает, что актиномицин D тормозил вступление клеток в фазу S, воздействуя на процессы, происходящие за 4′/г ч до начала синтеза ДНК, и не влиял на синтез ДНК в фазе S. В течение б’/г8′/г ч актиномицин D не влиял на число митозов’ и на процент меченых митозов при предварительном введении 3Нтимидина и, следовательно, не нарушал перехода клеток из фазы G2 в митоз. Это показывает, что в клетках асцитного рака Эрлиха фаза G: более чувствительна к низким дозам актиномицина D, чем фаза G2. При этом отсутствие влияния на клетки в фазе G2 имело место при полном блокировании перехода в фазу S.

Данные о влиянии ингибиторов синтеза РНК и белка на клеточный цикл не только характеризуют действие этих препаратов, но также дают важную информацию о роли нарушения синтеза РНК и белка в блокировании отдельных фаз цикла. В большинстве приводимых ниже работ в качестве ингибитора синтеза РНК использовался актиномицин D, а в качестве ингибиторов синтеза белка пуромицин и циклогексемид. В первичной культуре почки кролика актиномицин D тормозил инициацию синтеза ДНК при действии на первую половину фазы Gb а клетки во второй половине фазы Gi были значительно менее чувствительны (Kishimoto, Lieberman, 1964).